“普洱茶产黄曲霉致癌说”让消费者对普洱茶安全性引发争议，而试验结果表明，在普洱茶发酵过程中，接种的黄曲霉能在茶叶中生长繁殖，但随发酵时间的延长，黄曲霉在茶叶中的生长明显受到抑制，其数量逐渐下降。发酵终止时，未在茶样中检测出黄曲霉毒素。
黄曲霉毒素是真菌的次级代谢产物，主要由黄曲霉、寄生曲霉和集蜂曲霉等菌株产生，是世界公认的三大强致癌物质之一，是一种剧毒物质。所以，食品中若有黄曲霉毒素存在，就会极大地威胁着消费者的健康。黄曲霉是粮食和食品中最常见的真菌，但并非所有黄曲霉菌株都能产生毒素，据Smith、Aquire等人报道，从自然界中分离的黄曲霉菌株中，只有10%能产毒素。
2003年，台湾孙璐西将黄曲霉接种于云南晒青毛茶，进行模拟普洱茶渥堆试验，以验证普洱茶在受到黄曲霉污染的情况下是否产毒。试验发现，接种黄曲霉的毛茶中只有灭过菌的A组检出黄曲霉毒素（1.05μg·kg-1），且其量低于标准，其余B及C组皆未检出黄曲霉毒素。
2011年，徐丹等研究了黑曲霉对黄曲霉生长、产毒的抑制作用，发现黑曲霉既能抑制黄曲霉生长、产毒，又能降解AFTB1。
陈建玲等抽取了70份湿仓储存普洱茶样本，检测黄曲霉毒素B1、伏马毒素（Fumonisin B1，FB1）、呕吐毒素（脱氧雪腐镰刀菌烯醇，deoxynivalenol，DON）和T-2毒素的浓度，结果表明，湿仓储存普洱茶存在真菌毒素AFB1及DON不同程度的污染。
以云南大叶种晒青茶为原料，接种产毒黄曲霉进行模拟普洱茶发酵试验，并在发酵结束时通过LC-MS/MS法对茶样进行黄曲霉毒素检测，研究普洱茶发酵过程中黄曲霉的生长及产毒情况，为普洱茶生产安全、质量安全及饮用安全提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
茶样：2011年云龙晒青毛茶。
黄曲霉（A. flavus）菌株：引自云南省微生物研究所。YM 31880，来源于ATCC（美国菌种保藏中心）；YM 31882，来源于AS（中国科学院微生物研究所）。两株菌均能产黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2。
1.2 仪器设备
SW-CJ-1CU洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、ZHWY-2102摇床（上海智诚分析仪器制造有限公司）、YXQ-SG41-280电热手提压力蒸汽消毒器（上海医用核子仪器厂）、TEMI880恒温恒湿箱（上海一恒科学仪器有限公司）、101-3ABS恒温电热干燥箱（北京市永光明医疗仪器厂）、API3200 LC/MS/MS高效液相色谱串联质谱仪（美国AB公司）、LC-20ADXR液相色谱仪（日本岛津）、N-EVAP氮吹仪（美国Organomation公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 模拟发酵试验
发酵条件为环境湿度70%，潮水量35%，接种量5%（茶叶20 g，菌液1 mL），温度37℃，每7 d定期翻堆，取样进行菌落计数并观察微生物形态特征。发酵结束时取出堆样，用LC-MS/MS法定性定量检测。试验处理见表1。
1.3.2 LC-MS/MS法
黄曲霉毒素检测方法参照文献[16-17]进行改进。
取2.0 g混合均匀并捣碎的茶叶末于25 mL具塞比色管中，加1%盐酸溶液∶乙腈=3∶7的提取液15 mL，旋涡混匀后超声30 min，过滤，取滤液备用。
取滤液10 mL于多功能净化柱配套的试管内，缓慢压下多功能净化柱，保持1 mL·min-1的速度，完全压至试管底部，取净化后的提取液5 mL于10 mL比色管中，在40℃的温度下氮吹至尽干，用水∶甲醇=2∶8的溶液1 mL洗涤残渣，振荡混匀，用0.22 μm滤膜针头滤器过滤，滤液待测。
色谱条件：色谱柱为美国Waters公司Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。流动相A为水，流动相B为甲醇。
质谱条件：扫描方式为电喷雾正离子模式（ESI+）；检测方式为多反应监测（MRM）；喷雾电压5 500 V；气帘气30 kPa；碰撞气55 kPa；脱溶剂温度600℃；雾化气10 kPa；辅助气60 kPa。多反应检测条件见表2。
2结果与分析
2.1 黄曲霉菌种在PDA斜面上的生长状况
将保存的黄曲霉菌种YM 31880和YM 31882转接至PDA斜面上，28℃恒温培养，每隔3 d观察菌种生长状况，生长6 d后比较PDA斜面上菌种生长状况。如图1与图2所示，培养6 d后，YM 31880菌种在PDA斜面上生长出较多黑色菌核，菌落呈橘红色，气生菌丝稀少，孢子呈黄绿色；YM 31882菌种的气生菌丝生长旺盛，菌落呈黄绿色，有黑色菌核，孢子呈黄绿色。
2.2 菌种在发酵茶叶中的生长状况
图3为接种菌株发酵4 d后的茶样。发酵初期，黄曲霉在茶叶中生长较快，至发酵4 d时，茶叶中已有大量的黄曲霉生长（图3-A、3-B、3-D、3-E），但到8 d以后长势变弱；而对照组（图3-C，3-F）中未发现黄曲霉菌种生长。
2.3 计数结果
在发酵过程中接入产黄曲霉毒素菌株 (YM31880和YM31882)，发酵过程中菌株的生长变化情况见表3。由表3可知：原料茶均未检测到黄曲霉菌种，且在发酵过程中C、F两个对照组自始至终均未发现有黄曲霉菌种生长，而接种黄曲霉孢悬液的茶样中均检测到菌种。两株菌在接种后开始生长繁殖，随着发酵的进行，菌种数量在发酵8 d时达到最高，之后呈下降趋势。灭菌接种组（A、B）整体比未灭菌接种组（D、E）的黄曲霉菌种数量多，可能是由于灭菌组未受到原料茶中其他微生物的竞争抑制，而未灭菌组由于受到原料茶中微生物（尤其是优势菌种）的竞争抑制，黄曲霉菌生长态势较灭菌组弱，其中D组（未灭菌，接种YM 31880）在发酵第22 d时，黄曲霉菌数下降至0。
2.4 发酵茶样中霉菌的变化
研究表明，黑曲霉是普洱茶发酵过程中的优势菌种[18]。实验对选取黑曲霉与黄曲霉进行对比，两者在发酵过程中的数量变化见表4。由表中可知，未经灭菌茶样（D、E）在发酵过程中，黄曲霉和黑曲霉的生长都呈先迅速增长而后逐渐下降的趋势。黄曲霉在发酵初期的生长态势优于黑曲霉，但到发酵后期，黑曲霉作为优势菌种，其生长强于黄曲霉，说明两者之间存在竞争抑制作用。而对照（F）自始至终没有黄曲霉，黑曲霉生长则呈先增后降的趋势。说明普洱茶的发酵是以微生物为主导的固态发酵过程，发酵系统中存在多种微生物，但未受外源黄曲霉污染时，发酵过程中不会有黄曲霉菌生长。
2.5 发酵茶样中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2检测
2.5.1 黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的标准曲线和检测限
对质量浓度为0.5、1、2、5、10 μg·L-1的标准混合溶液，以峰面积（Y）对质量浓度（X，μg·kg-1）进行线性回归，得到标准曲线。4种黄曲霉毒素的标准曲线、相关系数及检出限列于表5。结果表明，4种黄曲霉毒素的线性关系良好。
2.5.2 发酵茶样中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2检测
选取A、B、C、D、E、F各组发酵出堆样品，用LC-MS/MS法检测黄曲霉毒素情况，结果见表6。由表6可知，原料灭菌接种产毒黄曲霉YM 31880和YM 31882的A、B处理，在发酵终止时虽有黄曲霉但不产毒；原料未灭菌接种产毒黄曲霉YM 31880的D处理在发酵结束时未检测到黄曲霉，也未检测到黄曲霉毒素；原料未灭菌接种产毒黄曲霉YM 31882的E处理，在发酵终止时有黄曲霉但不产毒。各处理的黄曲霉毒素检出率均为0。对照组C、F茶样中未检测到黄曲霉毒素。实验结果表明，普洱茶发酵过程中，未受外源黄曲霉污染的情况下，不会有黄曲霉生长；在受外源黄曲霉污染的情况下，会有黄曲霉生长，但茶叶中无黄曲霉毒素。原因是以茶叶为基质的发酵环境不利于黄曲霉产毒，还是所产毒素在发酵过程中被分（降）解，有待进一步研究。
3 小结与讨论
3.1 LC-MS/MS法适用于茶叶中黄曲霉毒素的检测
LC-MS/MS法具有选择性较强、重现性好、稳定性高的特点，对茶叶这种成分复杂的样品能在一定程度上减小基质效应的影响，进而有效地避免假阳性或者假阴性结果。该方法可为今后学科的进一步深入研究提供理论基础。
3.2 晒青原料作为基质不利于黄曲霉的生长及产毒
人们生活的很多环境中都存在黄曲霉，只有在适宜的条件下它才会繁殖代谢，产生黄曲霉毒素。模拟发酵实验表明，普洱茶的晒青原料接种产毒黄曲霉，在发酵过程中，虽然发酵初期黄曲霉能在茶样中生长繁殖，但在发酵后期黄曲霉的生长明显受到抑制，其数量逐渐下降，发酵终止时，生长在普洱茶中的黄曲霉最终不产黄曲霉毒素。
(责任编辑：茶小仙)
