一、什么是“氧化应激”
从生物学角度来看，人体的生命活动是难以计数的，酶促氧化一还原反应组成的。例如机体所需能整的产生，是在细胞当中的“发电厂”线粒体中的一系列氧化还原反应产生的。在其反应过程中，不可避免地产生大量的“中间产物”。这些“中间产物”就是所谓的“自由基”。即带有未成对电子的分子基团，反应活性极高。可攻击人体当中任何的分子，因而，这种物质常被称为“有害垃圾”。在正常情况下，这些“有害垃圾”或“自由基”可被细胞中的环卫系统一一“抗自由基”分子消除掉。当机体的垃圾清理系统能力不足或功能紊乱时，这些垃圾就会在人体中沉积。这些“垃圾“沉积到皮肤，人体皮肤便会出现“老年斑”；当这些“垃圾“沉积到心脏时，人体可出现心悸、心慌与气短；当这些“垃圾”堆积到脑组织时，就可出现学习记忆的障碍，如失眠、健忘等；当这些“垃圾”沉积到肾组织中时，人体便会出现肾功能的损害，如出现蛋白尿甚至血尿等。
所谓的“氧化应激”(Oxidative Stress ,OS), 其实就是机体在遭受各种有害刺激时，体内活性氧自由基(reactive oxygen species,RNS) 和活性氮自由基Creadive nitrogen species, RNS) 产生过多，氧化程度超出氧化物的清除能力，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。即体内“有害垃圾”的产生与“垃圾清除”失衡。垃圾产生大于垃圾清理，结果导致组织的损伤。
二、“氧化应激”与“衰老”有什么关系
其实人类认识氧化应激，最早源于对衰老的研究。1956年英国学者Harmna首次提出衰老的自由基学说，该学说认为自由基(Free radical)攻击生命大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因。后来，经过发现衰老的自由基学说并不完善。因此除了自由基的产生外，人体还有强大的抗自由基系统。不断丰富和深化对衰老的认识，提出了氧化应激的概念。多数衰老的病理变化与“氧化应激”有关。虽然衰老的病理机制仍未研究清楚，但根据目前的研究结果，人体内大多数器官组织细胞的衰老变化的原因都与氧化应激有关。例如，血管壁的老化是动脉粥样硬化的病理基础。
衰老人体血管内皮细胞的主要损害为氧化应激损伤。动脉粥样硬化是典型的老年病，血管璧粥样灶的主要病理损害原因为氧化应激。另外，动脉壁中层硬化是高血压的基础。高血压随增龄病情加剧。此外，氧化应激可导致老年白内障、胸腺萎缩、皮肤老年斑，并且也是老年精神病如痴呆的元凶，是导致感染性疾病和肿瘤发生而死亡的元凶。特别是这些病变又随着自然年龄增高而发生率增高，此前没有明显的临床表现，是隐秘地、逐步地发展到一定程度才表现出来整体性的多系统的慢性衰退的病变——衰老，衰老是发病率为l00%, 危害每一个人的生命的重大疾病，它的病理生理原来就是氧化应激。
三、现代医学采用什么手段抗“氧化应激”
现代医学发现，人体其实有内源性的抗氧化应激系统。这个系统常被称为“清道夫”系统，分两大类：一类为非酶性的抗氧化防御系统，主要包括维生素E、维生素C、维生素A 以及微量元素Zn+2等。这些维生素通过作为抗氧化剂，参与人体的代谢反应，来消除已经产生的自山基。它们的特点是参与人体的代谢，如果在饮食不当或疾病的情况下较易出现缺乏或不足的情况；另一类为酶类抗氧化防御系统，包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px)、过氧化氢酶等。
人体虽然有很强的抗氧化能力，但是随着年龄的增加，人体自身清除“垃圾”（自由基）的能力一天天下降，最后无力消除蓄积下来的”垃圾”。这些“垃圾”不仅仅是堆积的废物，而是具有高度反应能力的组织细胞破坏剂，其损伤组织细胞的能力堪比核辐射与X射线，结果导致老化速度呈指数级加速。因此，仅仅靠人体自身的抗氧化能力是远远不够的，需要从机体外获得额外的抗氧化物质。因为氧化应激损伤是每时每刻都在发生的事件，所以需要每天补充。其中，还有一个重要的原因就是部分抗氧化物质也不是很稳定，在人体内会被迅速转化。因此，现代医学中主要通过补充抗氧化的维生素达到这一目的。
普洱茶中含有丰富的抗氧化物质，其抗氧化物质的分子结构多种多样。其中有机酸，如没食子酸（Gallic acid）、咖啡酸(Caffeic acid)等；黄酮醇类（flavonols）、如槲皮素（quercetin）等，这些分子都被证明具有具有很强的抗氧化特性。但作为复合体的普洱茶，它们如何发挥抗衰老的氧化应激作用，既往没有研究。所以，课题组开展了本研究项目，即第一次用衰老的动物，对其最重要的内脏器官，如心脏、肝脏与脑组织的氧化应激状态进行分析，探讨普洱茶抗氧化应激方面的作用。
方法
SAM自然老化鼠为国际上公认的免疫治性研究动物模型，为了提高研究结果的国际认可度，故选用8月龄快速老化亚系(SAM-P8)雄性小鼠为试验鼠．并采用8月龄非老化系(SAM-Rl) 为对照鼠。8月龄SAM-P8鼠相当于70-80岁的老年人，8月龄的SAM-Rl鼠相当于人类的青壮年阶段，供试动物饲养于北京大学医学部实验动物中心，所有衰老小鼠在SPF级动物实验室饲养（这种动物实验室非常清洁，在这里面饲养的动物不易患感染类疾病，排除因感染导致老化鼠患病）。置于12h╱12h明暗交替环境，自由进食。所有动物实验操作均按北京实验动物管理条例执行(follow NIH guidelines)。
4周后，随机分为以下试验组，并分别通过灌胃给予不同剂量的普洱茶。青年对照组（SAM-Rl鼠）与老年对照组（SAM-P8鼠），先饲喂l周后开始灌胃蒸馏水，0.5ml/(日·只)连续28天。普洱茶饲喂组（包括低、中、高三个剂量组）：分别灌胃不同剂量的普洱茶提取物，灌胃剂量分别为125mg/(kg•bw)、250mg/(kg•bw)、500mg/(kg·bw),连续28天。动物灌胃普洱茶前与灌胃后，动物乙醚麻醉，眼眶取血，肝素抗凝。将部分肝素抗凝血液离心，3000rpm,离心30min。取血浆分装到EP管中，分2管，每管lOOμL，置于-70℃冰箱保存，待测。同时在无菌低温条件下打开小鼠的胸腔和腹腔，迅速摘取动物的心脏、肝脏、脑组织，用无菌生理盐水清洗后，迅速置于液氮中保存，待测。
本研究重点检测了动物组织氧化应激损伤代谢产物的含量和抗损伤酶的活性。
试验研究结果
1.普洱茶可清除衰老小鼠心脏、肝脏和脑组织中的有害“垃圾”丙二醛。
丙二醛(Malonaldehyde,通常简称MDA) 是自由基攻击机体内脂质成分后所产生的一类重要的小分子代谢产物。因而，MDA被当作生物机体氧化应激损伤的标志物(biomarker )。MDA 体内浓度的高低与机体遭受的各种辐射、毒素和氧化物所导致的氧化损伤直接相关。老年人由于自由基的长期产生，导致组织细胞损伤的累积，引起各主要器官的一系列损伤，这些损伤也成为导致老年性疾病的危险因素。例如，肝组织的氧化应激损伤与肝硬化，肝癌的发病有关；心肌的过氧化损伤与心肌缺血、心力衰竭等有关；脑组织的氧化应激损伤与智力减退、神经退行性疾病的发生有关。本试验中灌胃普洱茶水浸提物之后发现老化鼠体内的MDA水平显著降低，说明氧化应激损伤所导致的脂质过氧化产物明显减少，降低了动脉粥样硬化、高血压、糖尿病等各种心脑血管疾病发病的危险因素。其中，老化鼠心、脑和肝组织中MDA的水平显著高于青年鼠，但是灌胃普洱茶之后，这些主要器官中MDA的水平显降低，说明普洱茶具有很好的抗氧化损伤的作用，保护衰老机体的重要器官（图11-1: A,B,C)。
2.普洱茶可提高衰老小鼠心脏、肝脏和脑组织自由基内源性“清道夫”的活性
实际上，在人体、动物以及许多植物体中，都存在着内源性的抗氧化应激损伤的物质。其中，超氧化物歧化酶(SOD)是一种源于生命体的内源性的抗氧化的蛋白酶，SOD的作用是催化O2使其转变为H202。SOD 广泛存在于细胞的线粒体、细胞浆、细胞核甚至细胞外间隙。随时准备清除各处出现的自由基。因此SOD构成了人体抗损伤的第一道防线。
它能消除生物体在新陈代谢过桯中产生的有害物质。人每日接触的辐射、污染物、香烟、炎症以及许多化学药物等物质都能够产生自由基， 需要消耗人体内源性的抗氧化应激的物质。特别在老年人群和老年病患者中，清除自由基SOD活性由于产生不足，消耗增多，是构成衰老与哀老有关疾患的发病危险因素之一。大量的医学生物学研究报道，SOD活性随衰老而下降，并与许多疾病有关。但是，人为地增加外源性的SOD却没有获得想象中的有益的作用。目前证明，切实可行的手段是增加内源性的SOD, 或者避免SOD过快的耗竭。
本研究通过对衰老动物的研究发现，普洱茶提取物能够阻止老年动物体内SOD的下降。老化鼠体内的SOD与年轻鼠相比活性显著降低，但是普洱茶可以逆转这种趋势。通过灌胃普洱茶之后，可以显著增加老化鼠主要器官，例如心、脑和肝组织中SOD的活性，从而达到保护机体免受各种有害物质的伤害（图11-2:A,B,C) 。这些作用可能有助于抗衰老及预防老年性疾病。但普洱茶为什么能够恢复老年动物重要器官心、肝、脑的SOD活性，需要进一步研究。
SOD通常分为两种类型，一种是锰依赖型(manganese dependent SOD,Mn-SOD),主要存在于线粒体；另一种是铜锌依赖型(copper/zinc-dependent SOD,CuZn-SOD,主要存在于细胞浆或细胞核中。实验证明，这两种酶的活性对人体的寿命产生明显的影响。CuZn-SOD对于细胞和生物体的生命具有重要的影响。例如，生物科学家在线虫（C.elegans),果蝇（Drosophila）和小鼠 (mice)中都证明，这些生物的寿命与细胞内CuZn-SOD酶的活性成正比。
本研究试验结果表明，普洱茶可以显著增加老化鼠主要器官心、脑和肝组织中CuZn-SOD 的活性，说明可以保护机体免受来源于衰老机体中的ROS的损伤（图ll-3: A,B,C)。这些作用可能有助于抗衰老及减少与ROS关系密切的老年性疾病的发生。
3.普洱茶具加强机体多重抗损伤防线的作用
活性氧自由基伴随代谢而产生，因而，氧化应激损伤随时都会发生。为了应对时时刻刻都会产生的损伤，人类和动物在进化中发展了多重防护线。除了SOD以外，，生物细胞中还存在谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)）抗损伤系统，只是它们的分工不同。活性氧自由基ROS经过SOD酶的催化，转化为过氧化氢（H2O2），H2O2再经过GSH-Px的催化转化为水和分子氧。实验研究显示，GSH-Px活性随衰老的下降，与多器官的抗损伤能力下降有关。国际生物学家做了一些有趣的实验，发现单纯增加SOD的活性，并不能显著地对抗衰老，而同时增加GSH-Px的活性，则显著延长衰老动物的健康寿命。本试验证明，普洱茶可以显著增加老化鼠主要器官心、脑和肝组织中GSH-Px的活性（图11-4：A，B，C），这些作用说明普洱茶具有加强机体多重抗氧化损伤防线的作用。这与民间所观察到的普洱茶有益于老年人群的健康结果一致。
4.普洱茶提取物清除老年机体血管壁有害“垃圾”作用的失效验证
动脉粥样硬化以及血栓的形成是导致冠心病与脑中风的最主要的病理原因。老年人容易罹患心脑血管性疾病是人所共知的事实，但老年人为什么容易产生动脉粥样硬化与动脉血栓形成？目前生物医学家主要关注的是发病后的治疗，而对预防则关注较少。老年人的易发动脉粥样硬化与动脉血栓的原因与多种因素有关，但都与氧化应激损伤有关。老年人血管壁有一层内衬细胞，被称为“血管内皮细胞”。正常情况下，它们保护血管壁的光滑，维持血流通畅。同时，血管壁又是血液与管壁深层组织之间的界面，管壁深层组织的异常都与血管壁内皮细胞的异常有关。如黏膜下层的有害“垃圾”积存可导致的动脉粥样硬化，血管平滑肌组织及其间隙之间的有害“垃圾”积存可导致高血压，都存在严重的血管内皮细胞的损伤。老年人的血管内皮细胞遭受有害“垃圾”一一自由基的攻击，发生死亡，易于脱落。因而容易在外界的诱发因素作用下，形成动脉血栓。因而，保护血管内皮细胞有助于预防老年人的血栓形成。
众所周知，老年性疾病的预防并非易事，主要的难点在于需要一种可以长期应用的有效手段。实践证明普洱茶是一种可以长期使用的饮品，茶中所含的各种抗氧化物质可吸收入血，与血管内皮细胞密切接触，通过用微小的电流(1.0mV) 刺激小鼠的动脉，可造成血管内皮细胞的损伤，血管内血栓形成，阻断血流。本研究用同样的电流刺激老年小鼠和青年小鼠，发现老年小鼠血栓形成的时间很短，血流被很快阻断：而青年小鼠的血栓形成时间则很长。这些结果说明，老年小鼠血管内皮细胞的抗损伤能力明显低于青年小鼠。当给老年小鼠灌胃不同剂量的普洱茶水提取物1个月后[125-500mg/(kg•bw) ],这些老年小鼠的血栓形成时间不同程度的明显延长，说明普洱茶水提取物对老年机体易于形成血栓的趋向具有不同程度的阻止作用。
既然普洱茶对老年小鼠的血栓形成具有抑制作用，本研究又探讨了普洱茶对老年小鼠血管内皮细胞的抗氧化应激损伤作用。通过组织细胞分离消化与流式细胞技术，分别分离了青年小鼠与老年小鼠体内的内皮细胞，发现青年小鼠内皮细胞浆内自由基一一ROS产生明显少于老年小鼠。通过普洱茶水提取物与老年小鼠的内皮细胞共同培养后，其ROS的产生减少，说明普洱茶抑制了老年小鼠血管内皮细胞浆中的氧化损伤物质的产生，保护了老年动物的血管内皮细胞，有助于预防老年人血栓的形成（图11-5)。
五、普洱茶抗衰老氧化应激的优势分析
通过对以上试验结果的分析发现，普洱茶提取物对于活体的老年小鼠具有显著地抗氧化应激损伤的作用，作用原理主要表现在以下几个方面：
(1）对老年小鼠灌胃普洱茶水提取物[125-500mg/(kg•bw)]28天后，老年小鼠的重要器官心、肝与脑组织中的氧化应激损伤的标志物MDA含量显著下降。
(2)提高了老年小鼠内源性的抗损伤系统的活性。老年小鼠的重要器官心、肝与脑组织中的内源性的抗氧化应激损伤的酶系统，包括总超氧化物歧化酶(SOD)以及主要存在于细胞浆或细胞核中的铜锌依赖型（copper/zinc-dependent SOD, CuZn-SOD)显著下降.普洱茶提取物能够剂量依赖性地诙复老年小鼠机体的内源性的抗氧化酶活性。
(3)老年小鼠的重要器官心、肝与脑组织中的内源性的抗氧化应激损伤的酶系统，谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px) 活性随衰老而降低。普洱茶可以显著增加主要器官，心、脑和肝组织中GSH-Px的活性，这些作用说明普洱茶水具有加强机体多重抗损伤防线的作用。
(4) 血管内皮细胞损伤与血栓形成是最常见的，也是最严重的老年性疾病冠心病与脑中风的主要病理变化。普洱茶提取物保护了老年动物的血管内皮细胞，减少了老年动物形成血栓的趋向性。通过这个实例的研究，说明普洱茶提取物不仅可以对抗伴随衰老而产生的组织损伤，也可对抗因衰老而产生的老年性疾病，至少在活体动物身体中，显示出预防的作用。
衰老是产生老年性疾病的最大的危险因素。抗衰老虽然不能直接控制老年病，但是可以降低老年人群发生老年病的可能性。预防老年病并非易事，事实上，现代医学以及中国传统医学系统中不乏具有抗衰老的制剂，然而，没有一种制剂能够被国际上的各类人群，包括老年人群广泛持久地应用。普洱茶是一种能够为广大老年人群接受，并能持久应用的天然制剂。本研究用活体老年动物，证明了普洱茶抗衰老氧化应激的作用，并以最常见的老年心脑血管疾病作为实例，探讨普洱茶提取物通过抗衰老而预防老年病的可能性，为开发普洱茶的新用途提供实证性的依据。本项工作仅是一个开头，需要深入的研究，使其真正能够成为世界老年人群喜爱的健康饮品。
